Alternativas rápidas para detectar contaminación por Mycoplasma

Debido a su amplia distribución en la naturaleza, existe una alta incidencia de contaminación de sustratos y cultivos celulares utilizados en la producción y evaluación de productos biológicos, biotecnológicos y terapéuticos por Mycoplasma

Ilustración 1. Imagen adaptada de Rottem y Barile (1993). “Beware of mycoplasmas” que representa el efecto que puede llegar a tener una contaminación por mycoplasma en los cultivos celulares

El género Mycoplasma hace referencia al grupo de bacterias más pequeñas que existen en la naturaleza. Su tamaño es reducido, ya que no sobrepasa las 0,8 µm, no poseen una pared celular rígida y poseen una tasa de crecimiento muy lenta ya que carecen de varias vías metabólicas, que los hace dependientes de los componentes nutricionales provistos por el medio en el que se encuentran o de su asociación parasitaria con otras células.

Estos organismos se descubrieron hace más de 100 años y hasta la fecha hay más de 200 especies de mycoplasma descritas hasta el momento. Se han adaptado para sobrevivir en una amplia variedad de ambientes y organismos (plantas, insectos, reptiles, aves, mamíferos y humanos) (Volokhov, 2011). Aunque la mayoría no suele provocar enfermedades en los organismos infectados, la relación parasitaria con otro tipo de células provoca alteraciones en el metabolismo de las células huésped al modificar la cantidad de nutrientes disponibles en el medio.

Importancia de Mycoplasma en la industria

Hoy en día, los cultivos celulares se utilizan en distintos campos de la investigación, para el diagnóstico de enfermades y en la producción de biofármacos. Debido a las implicaciones que podría llegar a tener sobre la salud de las personas, tanto los operadores y usuarios, así como las entidades regulatorias prestan especial atención a los procesos de producción para minimizar las posibilidades de sufrir una contaminación por mycoplasmas ya que las células infectadas muestran alteraciones en su morfología, desciende la tasa de crecimiento, se altera el metabolismo celular y en ocasiones también se han observado aberraciones cromosómicas. Por lo que, cualquier contaminación con mycoplasma conlleva la pérdida de lotes de producción y de tiempo debido a cuestiones regulatorias y de seguridad del producto (Volokhov D 2011).

A pesar de la gravedad de sus efectos, la presencia de Mycoplasmas no provoca la muerte inmediata de las células, no se detecta en el microscopio debido a su tamaño pequeño y su lento metabolismo no genera turbidez del medio. De manera adicional, debido a la ausencia de pared celular, pasan a través de los filtros para esterilización y son resistentes a los antibióticos más utilizados por lo que no se pueden erradicar fácilmente.

Métodos de detección de Mycoplasma

Para prevenir la contaminación con Mycoplasma, es necesario seguir las buenas prácticas de laboratorio para cultivos celulares, así como realizar una evaluación periódica de los sustratos utilizados. Varios documentos regulatorios nacionales e internacionales (FEUM -Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos, USP – United States Pharmacopoeia, EP -European Pharmacopoeia, entre otros), establecen los métodos aplicables para detectar contaminación por Mycoplasma en productos biológicos generados en cultivos celulares, cultivos virales, producto a granel o producto terminado, y aquellos suplementos de origen animal que se utilicen en la preparación de los cultivos celulares.

Dos de los métodos más conocidos son el método de cultivo en medios nutritivos y el cultivo en Células indicadoras. El primero es un método microbiológico que, como su nombre lo indica, consiste en obtener cultivos de mycoplasma mediante el uso de medios especializados que favorecen el crecimiento de este tipo de bacterias y la detección consiste en la aparición de colonias en la superficie de placas de agar. Sin embargo, uno de los inconvenientes de este método es que existen cepas de mycoplasma no cultivables de manera aislada, debido a que dependen de las células a las que infectan, como se mencionó anteriormente. Además, de que la duración de la prueba es de 28 días, lo que limita su uso para la toma de decisiones relativo a un proceso.

Visualización con células indicadoras de contaminación porMycoplasma

El segundo método, conocido como detección mediante Células Indicadoras, utiliza cultivos de células VERO, a las que se les agrega la muestra que se desea evaluar y se incuban durante una semana para que, en caso de existir contaminación, los mycoplasmas tengan el tiempo suficiente para reproducirse y poderse detectar. Transcurrido el tiempo de incubación, se tiñe el cultivo con un colorante fluorescente que se une al material genético de las células. La presencia de contaminación con Mycoplasma se identifica por el patrón de tinción observado en la muestra. Este método de detección es muy útil para detectar cepas de Mycoplasma que no ha sido posible cultivar en medios nutritivos, además de ser económico y rápido. Sin embargo, dado que los mycoplasmas son organismos muy sensibles, es necesario que las muestras se procesen (desde su envío hasta el fin de la prueba) adecuadamente para no comprometer la supervivencia de estas bacterias.

Por otro lado, si existe riesgo de que el mycoplasma no sobreviva al trayecto al sitio de prueba o si se sospecha que la contaminación se encuentra en etapas muy tempranas, existe un método avanzado y recientemente autorizado por las entidades regulatorias que se conoce como Detección de mycoplasma por PCR el cual utiliza la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar el material genético de los mycoplasmas. El método utiliza primers dirigidos a una secuencia conservada en el gen del ARNr 16S del género, por lo que puede detectar varias especies de Mycoplasma. Además, incluye los controles necesarios para descartar la posible inhibición de la PCR por algún componente presente en la muestra, por lo que se evitan los falsos negativos.

Electroforesis en gel de agarosa para la detección de Mycoplasma por PCR

LEI ofrece alternativas para la detección de Mycoplasma

En los Laboratorios de Especialidades Inmunológicas contamos con el servicio de detección de Mycoplasma en cultivos celulares por células indicadoras y por PCR punto final, alineados a los requisitos del MBP 0740 de la FEUM. De manera adicional, se ofrece el servicio de identificación de microorganismos por secuenciación, en el caso de obtener un resultado positivo mediante el método de PCR. Esta información es importante porque nos permitiría identificar la fuente de contaminación por Mycoplasma.

Si necesita este u otro servicio, contáctenos, podemos ayudarle.

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Referencias:

MPB 0740. Detección de Micoplasma. FEUM 12a Ed. 2018. Pp: 582-584.

2.6.7 Mycoplasmas. Ph Eur 9.0

Miles, Roger; Nicholas, Robin (1998). Mycoplasma Protocols. Detection of Mycoplasmas in Cell Cultures by Cultural Methods. Methods in Molecular Biology Vol. 104: Mycoplasma protocols

Volokhov D, Graham L, Brorson K, Chizhikov V (2011) Mycoplasma testing of cell substrates and biologics: Review of alternative non-microbiological techniques. Molecular and Cellular Probes 25(2-3): 69-77.

Uphoff CC, Drexler HG (2014) Detection of Mycoplasma contamination in cell cultures. Current Protocols in Molecular Biology 28.4.